關(guān)于液相色譜峰的拖尾問(wèn)題的小知識
大家如果仔細查看色譜圖，就會(huì )發(fā)現幾乎每一個(gè)色譜峰都有一定程度的拖尾現象。
這本不是問(wèn)題，但是當拖尾嚴重到一定程度，就會(huì )影響我們的分析結果，所以今天就讓我們來(lái)談一談關(guān)于液相色譜峰的拖尾問(wèn)題。
什么是拖尾峰？
前沿陡峭，后沿較前沿平緩的不對稱(chēng)峰，稱(chēng)為拖尾峰。下圖就是一個(gè)拖尾峰，我們會(huì )發(fā)現這個(gè)峰的右半邊峰寬是大于左半邊峰寬的，尤其在基線(xiàn)處更加明顯。
那如何評價(jià)色譜峰的拖尾呢？絕大多數情況下制藥行業(yè)的從業(yè)人員會(huì )選擇用美國藥典（USP）中拖尾因子(Tf)來(lái)評價(jià)而其余的分析行業(yè)內人員則會(huì )選擇用對稱(chēng)因子（As）來(lái)評價(jià)，拖尾因子和對稱(chēng)因子到底有什么關(guān)系？
其中，拖尾因子Tf=(a+b)/2a，其中a和b分別是5%峰高處的左右半峰寬
對稱(chēng)因子As=c/d，其中c和d分別是10%峰高處的左右半峰寬
如果a=b，c=d，那么拖尾因子和對稱(chēng)因子的數值都等于1，也就是該峰不拖尾。實(shí)際工作中，當拖尾因子和對稱(chēng)因子小于2時(shí)，這兩個(gè)值是非常接近的，如下圖所示。
拖尾峰會(huì )對工作造成什么影響？
1. 影響峰高的計算
先來(lái)看看第一個(gè)峰（Tf=1.0）和最后一個(gè)峰(Tf=3.5)，它們的峰面積雖然是相同的，但是由于最后一個(gè)峰拖尾很?chē)乐?，所以它們的峰高相差三倍。當我們使用峰高?lái)計算最低檢出限時(shí)拖尾峰的負面影響就會(huì )比較明顯。
2. 影響峰面積的計算
當我們對色譜峰進(jìn)行積分來(lái)計算峰面積時(shí)，峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)通常情況下通過(guò)色譜峰的斜率來(lái)確定。色譜峰越拖尾，它的尾部基線(xiàn)越平緩，終點(diǎn)就越難確認。這一點(diǎn)在基線(xiàn)波動(dòng)較大時(shí)體現的更加突出，那么它就會(huì )影響我們積分得到的峰面積。
3. 影響對某些痕量組分的確認
在藥典計算有關(guān)物質(zhì)的相關(guān)要求中會(huì )提到，峰面積達到主峰面積0.1%的組分都要參與計算。
那么當一些小峰和前面的峰分離度不是很好時(shí)就會(huì )容易被隱藏在前面峰的拖尾處從而無(wú)法參與計算。
綜上所述，拖尾峰會(huì )對色譜分析的定性定量結果都會(huì )產(chǎn)生影響。
產(chǎn)生拖尾峰的原因是什么？
1、拖尾峰的形成是因為在色譜分離時(shí)出現了一種以上的保留機制，并且其中一種保留機制是超負荷的。在日常分析中大多數情況下會(huì )使用反相色譜。以常用的C18柱為例，C18是被鍵合在載體硅膠表面的，而硅膠是由硅和氧聚合而成的，所以它的表面會(huì )出現各種形態(tài)的硅羥基。
雖然理想的狀態(tài)是流動(dòng)相中的樣品只和固定相C18發(fā)生作用。而實(shí)際上一半以上的硅膠表面并沒(méi)有被鍵合上C18，所以硅膠表面會(huì )裸露出大量的硅羥基（Si-OH）。
而單獨的自由硅羥基會(huì )和流動(dòng)相中的樣品發(fā)生作用，形成拖尾。于是在最近的十幾年中，色譜柱供應商致力于生產(chǎn)出高純度的硅膠載體。由于新型硅膠在無(wú)金屬離子環(huán)境下制造，所以表面不會(huì )殘留金屬離子也會(huì )減少拖尾。另外，硅膠表面盡可能減少自由的硅羥基，未與固定相鍵合的硅羥基盡可能形成螯合或聚合狀態(tài)，用來(lái)減少拖尾峰的產(chǎn)生。
2、當色譜柱經(jīng)歷過(guò)高溫、強酸，或者一些極端使用方法導致固定相流失較多后，色譜柱中的自由硅羥基也會(huì )變得越來(lái)越多從而更加容易造成拖尾峰。
3、拖尾峰的形成也有可能是因為柱外的死體積較多，導致樣品在死體積處發(fā)生了滯留和擴散。
4、當樣品中出現了堿性化合物，堿性基團更容易與色譜柱中的硅羥基發(fā)生作用形成拖尾峰。
如何改善拖尾峰？
1、對于過(guò)去的自由硅羥基較多的色譜柱，建議在流動(dòng)相中加入三乙胺來(lái)抑制拖尾。實(shí)驗表明三乙胺有非常好的拖尾抑制效果。另外，由于三乙胺呈堿性需要大家在使用時(shí)考慮色譜柱的ph值耐受范圍，某些情況可能需要加入酸性調節劑。對于新型的表面以耦合和聚合硅膠為主的硅膠載體，我們就很少使用三乙胺來(lái)抑制拖尾，而是通過(guò)調整流動(dòng)相的ph<3來(lái)抑制硅膠的離子化。
2、當色譜柱柱效降低導致拖尾峰時(shí)建議更換色譜柱。
3、建議在液相色譜中正確安裝并且使用與您的儀器匹配的管線(xiàn)接頭，以減少死體積的產(chǎn)生。
